Vogel en Griep

Vogelgriep literatuurstudie

Infoteur: Heidweiller

Vogelgriep literatuurstudie

H5N1, beter bekend als de vogelgriep heeft in het afgelopen decennia een hoop veranderingen ondergaan. De mutaties volgen elkaar zo snel op dat geheel nieuwe genotypen gevonden zijn. Door kleine mutaties zorgde het vogelgriep virus in korte tijd, voor angst onder miljoenen mensen. Hoe heeft het virus kunnen muteren? Het antwoord ligt minder bij vogels dan je zou vermoeden, varkens blijken een cruciale factor te zijn voor het ontstaan van nieuwe pathogene virussen.


Index


Samenvatting

H5N1, beter bekend als de vogelgriep heeft in het afgelopen decennia een hoop veranderingen ondergaan. De mutaties volgen elkaar zo snel op dat geheel nieuwe genotypen gevonden zijn. Door kleine mutaties zorgde het vogelgriep virus in korte tijd, voor angst onder miljoenen mensen.

Hoe heeft het virus kunnen muteren? Het antwoord ligt minder bij vogels dan je zou vermoeden, varkens blijken een cruciale factor te zijn voor het ontstaan van nieuwe pathogene virussen.

Om dit virus in de kiem te smoren dienen we een beeld te vormen hoe het virus er uit ziet. En vooral, moeten we antwoord krijgen, op waarom de huidige varriant zo pathogeen is. Het antwoord is te vinden in de receptoren van het H5N1 virus. Door verschillende methoden los te laten op het virus hebben we nu een beeld kunnen vormen wat er allemaal gebeurd in het virus en welke gevolgen een besmetting met zich mee kan brengen. Recent is zelfs een nieuwe varriant van de hemagglutine receptor gevonden.

Met nieuwe vindingen, nieuwe ideeën en innoverende strategieën heeft men eindelijk een idee kunnen vormen hoe we een vaccin op grote schaal zouden kunnen maken. Er is echter nog een lange weg te gaan voordat er daad werkelijk een produceerbaar vaccin te maken is.

Inleiding

Influenza is eigenlijk niets meer dan een griepvirus. In de literatuur zijn er veel soorten influenza bekend. Maar er zijn maar een paar typen instaat om een griepepidemie te veroorzaken. Deze jaarlijkse griepepidemie ontstaat, wanneer een vogelgriep virus, potentieel niet gevaarlijk voor mensen, door overbrenging op varkens, welke vatbaar zijn voor varkens– als aviaire virussen, krijgt het virus de kans te muteren door recombinatie tussen beiden. De varkens virussen zorgen ervoor dat mensen ook ziek kunnen worden.

De influenza A soort, die we hier zullen bespreken is op zichzelf weer in subclasses te verdelen. Deze classificering gebeurd aan de hand van antigene verschillen op het oppervlak van twee glycoproteïnen, hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA). Sinds kort zijn er 16 verschillende HA subtypen en 9 NA subtypen bekend in influenza A. Tot 2006 waren er maar 15 HA typen bekend. Deze subtypen zijn allemaal terug te vinden bij vogels. Hierdoor zouden we vogels een soort reservoir kunnen noemen voor het virus. Zowel de HA antigenen als de NA antigenen spelen een rol bij binding aan de celwand en het vrijkomen van nieuw geproduceerde virussen uit een geïnfecteerde cel.

Influenza A muteert gemakkelijk via recombinatie van de HA en NA segmenten. Dit komt doordat het virus een 8 singlestrand negatief RNA gesegmenteerd genoom heeft waardoor mutatie langs de zogenaamde antigene shift plaats vindt. De naam van dit proces geldt alleen voor influenza en wordt in bij andere virussen reassortment of virale shift genoemd. Bij dit proces, worden na besmetting de subtypen uitgewisseld tussen verschillende soorten influenza en er ontstaat zo een nieuwe soort.

Er bestaat nog een manier waarop een virus kan muteren. Dit is antigene drift. Hierbij vindt een mutatie plaats in het genoom, coderend voor de glycoproteïnen, waardoor het virus in staat wordt het immuunsysteem van de gastheer te omzeilen.

Het in de volksmond genoemde vogelgriepvirus wat nu zo actueel is, is samengesteld uit hemagglutinine 5 en neuraminidase 1. Vandaar dan ook de naam H5N1. Het ontstaan van H5N1 heeft plaats gevonden door antigene shift van een virus die verantwoordelijk was voor een grote griep uitbraak in Hongkong in het jaar 1997. Hieruit is in 2002 het genotype Z ontstaan. Dit genotype is 1 van de 8 nieuwe genotypen (V, W, X1, X2, X3, Y, Z en Z+)die na 2002 gevonden werden. Voor dit jaar werden alleen de genotypen A-E gevonden, maar deze werden vanaf 2002 niet meer aangetroffen.

Veel griepvirussen vinden hun oorsprong in Azië. De redenen hiervoor zijn de slechte hygiëne in combinatie met de grote massa’s mensen en vee die dicht op elkaar leven. De eerste uitbraak van H5N1 vond dan ook plaats in Azië, maar werd alleen bij mensen gerapporteerd in Vietnam en Thailand. Er werd toen nog aangenomen dat de eerdere uitbraak van 1997 de zelfde oorsprong kende als de uitbraak toen. Men ging er vanuit dat de virussen van elkaar te onderscheiden waren aan de hand van hun antigenen.

Bij deze mutatie werd de suggestie gewekt dat er sprake was van een gefixeerde mutatie binnen M2. De mutatie in M2, welke een transmembraanproteïne is en een ionenkanaal voor het uncoating proces van het virus, verklaarde de aanwezigheid van de amantadine resistentie. Dit werd later bevestigd door middel van fenotype essay.

In 2005 was er steeds meer sprake van een toename in het aantal infecties in mensen. Er werden dodelijke infecties gemeld Thailand, Cambodja, Indonesië en Hongkong. Verder werd melding gemaakt van ademnood, diarree, leverfunctie stoornissen en neurologische stoornissen. Hierdoor werd het aannemelijk gemaakt dat er nieuwe mutaties ontstaan, waarbij er mens-mens besmettingen ontstaan.

Zoals eerder verteld zorgen virussen uit varkens ervoor dat mensen ziek kunnen worden. Dit varkensvirus is niet per definitie overbrengbaar van mens op mens, maar kan mensen wel ziek maken. Door de steeds verdere toename van H5N1 infecties in mensen, wordt het steeds meer aannemelijk dat er nieuwe mutaties langs antigene shift ontstaan, waarbij mens-mens besmettingen mogelijk wordt. Doordat de wereldbevolking nog geen immuniteit heeft tegen H5N1, is het van belang om grote hoeveelheden vaccin te produceren. Om dit te kunnen, is het nodig een duidelijk beeld te scheppen welke receptor proteïnen betrokken zijn bij de besmetting en welke mutaties er zijn opgetreden.

Hoe ziet H5N1 er uit?

Zoals u eerder heeft kunnen lezen, vindt subtypering van influenza virussen plaats aan de hand van 16 hemagglutinines (H1 tot H16), en 9 neuraminidase types (N1 tot N9). Hemagglutinine bindt hierbij aan de sializuur receptoren van het celoppervlak, waardoor het in staat is zich aan de gastheercel te binden en zichzelf te injecteren in de cel. Doordat HA deze rol vervult, vormt het de hoofdunit in het vormen van een humoraal immuunrespons. De affiniteit van HA is bepalend voor het soort gastheer die het kan besmetten. Denk hierbij terug aan de varkens.

HA bindt bij mensen via de sializuur receptoren aan galactose in de menselijke luchtwegen. Dit gebeurd doormiddel van -2,6 bindingen, welke ook gevonden worden in varkens. Het feit dat varkens zowel de -2,3 – van vogels als de -2,6 binding kennen in hun luchtwegen, verklaard hoe varkens kunnen dienen als “mix capsule” voor het virus.

Zoals eerder te lezen, speelt ook neuraminidase een belangrijke rol in de pathogeniteit van influenza. NA bindt aan glycosidische verbindingen, welke we kunnen vinden aan de sializuren. Deze zijn zowel gebonden aan de gastheercel als aan het oppervlak van de virale deeltjes. Na binding vaan deze glycosidische binding, zorgt NA voor het verspreiden van de vironen binnen de gastheer.

Het transmembraanproteïne M2 vormt een ionkanaal, waardoor het de pH-afhankelijke dissociatie van matrix proteïnen van het nucleocapside reguleert tijdens het uncoatings proces van het virus. Ook is het verantwoordelijk voor pH veranderingen langs het trans-Golgi netwerk bij de rijping van de hemagglutinine moleculen. De virusremmende adamantanen: amantadine & rimantadine, zijn in staat te binden aan M2.

Influenza heeft in het verleden eerder voor pandemieën gezorgd. Dit komt omdat zij hun 8 negatieve single strand RNA’s snel uit kunnen wisselen, een proces wat we antigene shift noemen. Deze uitwisseling zorgt voor mutaties. Door deze shifting hebben er van 1918-1919 (H1N1), 1957 (H2N2) en in 1968 (H3N2) pandemieën plaats gevonden.

Voor dergelijk gemuteerde virussen is het moeilijk om een effectief vaccin te ontwikkelen. Het ontwikkelen van een effectief vaccin wordt ook nog eens bemoeilijkt, doordat influenza een zogenaamde “virus pool” vormt in vogels en zoogdieren, waardoor een kleine verandering in het antigen van hemagglutinine of in de neuraminidase makkelijk ontstaat. Hierdoor moeten risicogroepen ieder jaar een nieuw griep vaccin halen. Onder deze risicogroep vallen vooral astma patiënten, ouderen en andere doelgroepen met een verlaagde weerstand.

De eerder genoemde 8 RNA segmenten bevatten coderingen voor 11 verschillende virale proteïnen. Deze omvatten de polymerase proteïnen (PB1, PB2, PA, PB1-F2), nucleocapside proteïne (NP), hemagglutinine, neuraminidase, matrix proteïnen (M1, M2), en non-structurele proteïnen (NS1, NS2).

Onderzoek

Sequencing
Aan de hand van monsters van patiënten die leden aan een zware long ontsteking en die tevens blootgesteld waren aan gevogelte tijdens de influenza uitbarsting van 2003-2004 vond sequencing plaats. Om het virus te kunnen isoleren, werden de supernatanten van deze monsters in resusaapnieren en/of Darby hondsnier cellen gebracht. Door een immunofluorecentietest met monoklonaal antilichaam, geconjugeerd met Goat anti-mice IgG kunnen de isolaten geïdentificeerd.

Subtypering van H5 vond plaats via RT-PCR technieken. Hierbij produceerden de gebruikte primers (Ha-1144 en H5-1735R vergrote producten van 591 bp. De subtypering van N1 vond plaats door een vergelijking te maken tussen vijf monsters, geïsoleerd uit Thaise H5N1 patiënten en deze af te spiegelen naast een monster H5N1 uit een kip. De monsters werden bij titers van 25, 50 en 100 TCID50, getest tegen concentraties gamantadine ml-1 (sigma-Aldrich) in MDCK cellen doormiddel van schaakbordtitratie. Ter positieve controle werd een H1N1 virus gebruikt. Als negatieve controle werd er gebruik gemaakt van een H3N2 virus.

Na de pre-incubatie, werd de drug vervangen, waarna hetzelfde proces herhaald werd bij een hogere temperatuur. Vervolgens werd de hoeveelheid virus in de monolayer van de cel bepaald doormiddel van ELISA. De hoeveelheid NP proteïne was gelijk aan de gemiddeld gemeten OD van de besmette culturen zonder drug. Wanneer culturen besmet zijn met een amantadine-gevoelig virus zouden deze minder moeten produceren dan 50% van de totale hoeveelheid NP proteïne.

Om de cellen te rangschikken, werd er viraal RNA gebruikt als nucleotide bron. Dit gebeurde na 1 á 2 passages in llc-MK2- of MDCK cellen.

Om de expressie producten van de genen PB2, PB1, PA, Ha, NA en NS te vergroten werd gebruikt van RT-PCR technieken. De beschrijving hiervan is te vinden in Hoffmann et al. (2001).

De uit de RT-PCR verkregen DNA producten kunnen met electroforese technieken (1% agarose) opgezuiverd worden. Hierna word het geïsoleerde DNA als target gebruikt voor de sequencing van de nucleotiden. Hiertoe wordt gebruik gemaakt van een Cyclus Sequencing kit (Prisma 310/377). De gehele analyse is terug te vinden in de GenBank.

Het vergroten van de gen expressie producten
Om de expressie van PB2, PB1, PA, HA, NP, NO, Na, m en NS van verschillende genen te vergroten wordt gebruik gemaakt van RT-PCR technieken. Na het uitvoeren van een RT-PCR, werden vergrootte expressie producten verkregen. Tevens werd er ook een 29 mer oligonucleotide voor alle producten gevonden. De beschrijving van de RT-PCR is te vinden in Hoffmann et al. (2001).

Met luciferase-assay wordt de transcriptie- en replicatie-activeit bepaald
Na de RT-PCR werd met transfectie in MDCK/293 cellen recombinant plasmide verkregen. Hieruit werden 293T cellen gemaakt. Deze cellen hebben ieder PB2, PB1, PA en NP met een luciferase reporter plasmide. Hiermee werd de polymerase activiteit van zowel het recombinante als het CH58 (niet pathogeen) virus bepaald. Het M segment van het influenza virus controleert het cDNA wat codeert voor luciferase. Dit zorgt ervoor dat we tijdens de gehele transcriptie luciferase activiteit kunnen waarnemen, maar het is zo ook mogelijk de replicatie activiteit van het polymerase complex te achterhalen.

Celfuncties tonen de groei en verspreiding van het virus aan
  • Met het zogenaamde 8 plasmiden systeem wordt bepaald welke gen segmenten voor de hoge virulentie van het virus zorgen. Met deze 8 plasmide sets, werd een RG (pathogeen) virus en CH58 recombinant virus verkregen door DNA transfectie (H 4.4).
  • De cellen werden geïntroduceerd in fretten en muizen. Muizen hebben minder snel de neiging om virussen te repliceren dan fretten, waardoor fretten beter te bestuderen zijn.
  • Wanneer er naar de plaques wordt gekeken van de MDCK cellen en de CH58, kunnen we iets vertellen over de groei van de soorten cellen.
  • Vervolgens werden er titers bepaald van zowel de muizen als fretten
  • De RG virussen waren dodelijk voor de gebruikte proef fretten, de CD58 virussen waren dit niet. RG bleek ook voor muizen dodelijk te zijn.
  • CD58 bleek geheel onschadelijk, muizen die werden geïnfecteerd met 106 EID50 bleven zelfs in leven. Infectie met MDCK cellen met recombinant virus resulteert in grote plaques, CH58 geeft kleine plaques.
  • De groei en verspreiding van het virus werd met titers bepaald. Er werden bij de fretten met gerecombineerd virus, hoge titers gevonden in de hersenen, mild, lever en in het longweefsel. Bij de met CD58 geïnfecteerde cellen werd niets aangetroffen.
  • Gerecombineerde virussen werden aan de hand van bepaalde celfuncties geselecteerd. Zo werd er gekeken naar oppervlakte glycoproteïnen, complexe polymerase genen en het NS gen.

Vaccin ontwikkeling
Voor het ontwikkelen van het vaccin werden de volgende (H5N1) griepvirussen gebruikt: VN/1203/04 en a/Hongkong/156/97 (H5N1) (HK/156/97). Deze virussen zijn op te vragen bij the World Health Organization en vallen onder de klasse 3+. De virussen werden opgekweekt in kippeneieren gedurende 26 uur bij 37°C. Vervolgens werden zij opgeslagen bij - 70°C.

Resultaten

Sequentie en pathogeniteit
  • Zowel de monsters die van de kip genomen waren, als die van mensen waren genomen kennen een PQRERRRKKRG sequentie die ligt op hun cleavage site. Dit was hetzelfde als bij het A/Hongkong/156/97(H5N1) virus. Deze gelijkenis vormd een verklaring voor hun hoge virulentie.
  • Dit komt doordat de cleavage van het HA molecuul met gastheercel protease essentieel is voor de virale activiteit. De mate van pathogeniteit wordt dus bepaald door de cleavage. Hierbij zijn de HA1 en HA2 subunits essentieel.
  • Het splicen van Ha (HA0), door gastheercel proteasen, geeft twee aan bisulfide gebonden HA1 fragmenten.
  • Griepvirussen met veel herhalingen in hun basisaminozuur sequenties, kennen veel replication sites. De aanwezigheid van de vele replication sites draagt bij aan een hoge mate van pathogeniteit bij zowel vogels als zoogdieren
  • De geïsoleerde Hongkong/1997 H5N1 virussen bleken erg dodelijk te zijn bij vogels en fretten. Dezelfde virussen waren van zowel hoge als lage pathogeniteit bij muizen. Door substitutie van glutamine voor lysine op az 627 van het PB2 molecuul, werd aangetoond dat deze associeert met H5N1. Bij lysine blijkt besmetting dodelijk, daar waar hij voor glutamine niet dodelijk is. Bij drie isolaten van de uitbraak in Thailand, werd 1 keer glutamine gevonden en bij de andere twee lysine, wat de agressieve aard van de uitbraak verklaarde.
  • De monsters uit Thailand en de andere genotype z virussen bleken bijna identiek aan de monsters uit Hongkong te zijn. Hun aminozuren aan het Na uiteinde tellen er 20, tegen 19 op die van het Hongkong virus.
  • De H5N1 monsters die tijdens de uitbarsting van 2003-2004 in Zuidoost-Azë genomen waren, blijken resistent te zijn tegen zowel amantadine als rimantadine. Dit werd getest via drug-sensitivity assay in MDCK cellen. Hier werd vervolgens een vergelijking mee gedaan tegenover H1N1 en H3N2 aan de hand van hun TCID50.

De specificiteit van de Influenza A/H5 virussen receptoren
Bij het bestuderen van de receptor specificiteit, waaronder ook menselijke isolaten werden bestudeerd, bleken alle monsters, op 2 na, een hoge affiniteit te hebben voor de Sia2-3Gal receptoren. De overige twee, toonden verminderde affiniteit voor de receptoren van de vogelachtige en een gematigde affiniteit te kennen voor de menselijke Sia2-6Gal receptor.

Deze twee soorten virussen hadden een verandering ondergaan op hun ser277-Asb hemagglutinine. Hieruit valt kunnen we opmaken dat één enkele verandering de receptorspecificiteit voor menselijke griepvirussen kan bepalen.

Virusbesmetting vindt plaats door de interactie van viraal HA en sialischzuur, met de doelcellen. Virussen tonen meestal, afhankelijk van hun gastheer, een voorkeur voor één van beide. Interactie vindt plaats aan disacharide epitopen op de gastheer (# 945;2–3Gal1 of Neu5Ac& # 945;2–6Gal1). De voor mensen virulente H1, H2 en H3 subtypen binden. #945;2–6-gebonden sialisch zuur, deze vorm wordt gevonden in het ademhalingskanaal van de mens. Bij de voor vogels virulente virussen binden zij aan Neu5Ac& # 945;2–3Gal1, welke te vinden is in het verteringsstelsel van vogels.

De meeste H5N1 virussen, die zijn voortgekomen uit de Aziatische stamlijn van H5, tonen een bijna identieke affiniteit voor 3& # 8242;SLN2 en su-3& # 8242;SLN2. Vergeleken met hun affiniteit voor niet gesulfateerd SiaLEx, kennen zij een verminderde affiniteit voor su-SiaLex.

Na 2003 vond een grote verandering plaats in de affiniteit van H5N1 voor hun receptoren De virussen, geïsoleerd uit de uitbraak van 2004 in Vietnam en Thailand, toonden bij zowel vogels als mensen een bijna 20 keer zo hoge affiniteit voor su-SiaLex dan voor niet gesulfateerde SiaLex. De nieuwe isolaten zijn dus veel pathogener dan de isolaten voor 2003.

Bij de Thailand virussen werd de affiniteit voor een bepaald soort gastheer, aan de hand van het karakteriseren van amizuurresiduen op de receptor-bindingsplaats bepaald. Met deze analyse werden voor zowel de menselijke monsters als de monsters die genomen waren van de besmette kip, de aminozuurresiduen voor 100% bepaald.

De menselijke H5N1 virussen blijken een voorkeur te hebben voor binding aan sialyl-oligosaccharide receptoren met een 2,6 binding aan galactose, de vogelvirussen daarin tegen blijken een voorkeur te hebben voor cellulaire receptoren met een 2,3 binding.

De specifieke aminozuren van de isolaten uit Thailand bleken veelal specifiek voor vogels te zijn. Er zijn inmiddels 32 verschillende aminozuurresiduen gevonden in M1, M2, NP, PA en PB2, welke aan gastheerspecifieke residuen blijken te binden. Hierna werd er gekeken welk residu waar precies affiniteit mee had. Van deze 32 residuen, bleken de virus isolaten van Hongkong voor vogels residu te tonen bop 23 plaatsen, menselijk residu op 5 plaatsen en een mengsel van beiden op 4 andere plaatsen. De H5N1 virussen uit Thailand bleken hier echter op 31 plekken vogelspecifiek residu te maken en maar op 1 plek een menselijk residu. ……

Waar vinden de Thailand virussen hun oorsprong?
In de regio bleven de voorvaderen van het virus circuleren. Daarbij hebben de Gs/GD-achtige virussen door herschikking met andere onbekende watervogelvirussen ondergaan. Hierdoor ontstonden in Hongkong rond 2001, nieuwe, herschikte virussen, die ook op land vogels over gingen. Deze nieuwe typen werden geclassificeerd in de genotypen A–E, gebaseerd op de bron van elk genoom segment.

Zoals te lezen in de inleiding, werden er na 2002 andere genotypen gevonden (V, w, X, y, Z+ en Z) en ging de eerdere manier van classificeren niet langer op. De nieuwe genotypen zijn waarschijnlijk ontstaan, doordat zij hun HA en NA genen vermoedelijk gekregen hebben van een Gs/GD-achtig virus en genen hebben uitgewisseld in onbekende vogel soorten.

Door fylogenetische analyse, blijkt dat de in Thailand geïsoleerde virussen een genetische verwantschap hebben met genotype Z.

Bij de virussen is een deletie te zien van 5 aminozuren op de NS receptor, en een 20 aminozuur tellende deletie op NA. De in Thailand geïsoleerde virussen, vertoonden een Ha en Na, zoals deze ook te vinden waren in de Gs/GD-achtige virussen. PB2, PB1, PA en NS kwamen gewoon overeen, de NP en de M genen komen van een andere lineage, welke mogelijk gedeeld wordt door de genotypen Y, Z+ en Z voor NP en door genotypen V, W, Z+ en Z voor M. De Thailand isolaten vormden afzonderlijke subclusters, deze waren eenvoudig te onderscheiden van het hier dicht aan verwante genotype Z.

Adenovirale vectoren, welke coderen voor het hemagglutinine van H5N1 genereren snel. Serotype 5 adenovirus vectoren met een E1/E3-deletie werden gegenereerd. Deze brengen UpGene algoritme codon-geoptimaliseerde HA genen tot expressie, in zowel hun volle lengte als in de HA1 of HA2 subunits. Constructie van deze vectoren vond plaats in CRE 8 cellijnen. Hieraan toegevoegd werd een vector geconstrueerd die het HA1 gedeelte bevat. De totale generatie duurde 36 dagen. Hieruit kunnen we concluderen dat er bij het maken van een vaccin de mogelijkheid moet zijn om deze snel te manipuleren en te genereren.

Recombinante virussen hebben grotere plaques
In de plasmide bij de tests fretten, bleken de RG virussen dodelijk te zijn en de CD58 virussen niet. RG bleek ook in muizen dodelijk te zijn. CD58 bleek geheel onschadelijk, muizen die werden geïnfecteerd met 106 EID50 bleven zelfs in leven. Gekeken naar de plaques geeft infectie met MDCK cellen met recombinant virus grote plaques, CH58 geeft kleine plaques.

Transcriptie/replicatie activiteit
De cellen die behandeld zijn met het gerecombineerde (pathogene) virus vertoonden op hun NP complex 3 tot 5 keer zo veel luciferase activiteit dan de CH58 cellen. Dit leidt tot de conclusie dat het pathogene virus een hogere transcriptie/replicatie activiteit heeft dan het verlaagd pathogene CH58 polymerase.
Nog essentiëler blijken PB1 en PB2. De luciferase activiteit van PB2 is bij het CH58 polymerase maar 22% van het normale isolaat, voor PB1 was dit 58%.

Immuniteit en bescherming bij gevaccineerde muizen
Er werden acht groepen gemaakt van zes weken oude BALB/c muizen. Vervolgens werden deze intramusculair ingespoten met 5 × 1010 virus deeltjes. Deze deeltjes zijn afkomstig van Ad.VNHA, Ad.VNHA1, Ad.HKHA1, of de lege Ad.5 vector en na 14 dagen herhaalt.

Hier naast werden er muizen op een soort gelijke manier gevaccineerd met Ad.VNHA, Ad.VNHA1, Ad.VNHA2, of de lege Ad.5 vector. Serum van de muizen werd bekeken op antibody respons. In de 10e week na aanvang van het experiment, werd in iedere groep een hoge titer voor H5-specifieke antilichamen gevonden, behalve bij de groep die ingeënt was Ad.VNHA2. De laatst genoemde toonde drie keer zo lage titers .

Er werd hierna gekeken in welke mate de antilichaam reacties in staat zijn om homoloog VN/1203/04 and heterosubtypische HK/156/97 influenza virusstrengen te neutraliseren. Dit werd gedaan door gebruik te maken van Horse red blood cell HI assay. Wanneer gevaccineerd wordt met het volledige HA, vindt er inductie van homologe & heterotypische antilichaam respons plaats. Vaccinatie met Ad.VNHA1 of Ad.HKHA1 echter, induceert antilichaam respons, welke specifiek is voor die chain. Hieruit kunnen we concluderen dat een enkele immunisering genoeg moet zijn om een hoge anti-HA respons te krijgen.

Humorale immuun respons in gevaccineerde muizen
Er treedt een Anti-H5N1 HA IgG respons op. Per groep werden de sera van 8 muizen per groep behandeld met receptorvernietigend enzym, 8 weken nadat de tweede immunisering plaats had gevonden. Deze werden vervolgens met ELISA technieken getest op de aanwezigheid van H5-specifiek antilichaam.

Er treedt H1 antilichaam respons op in het serum. Acht weken na de 2e vaccinatie werden de sera van de VN/1203/04 en HK/156/97 besmette muizen getest op HI specifiek antilichaam eveneens met ELISA technieken.

Er werden verschillende gradaties van humorale immuniteit gevonden. Hierin viel vooral op dat de Ad.VNHA2-groep een aanzienlijk lagere H5-specific antilichaam respons vertoonde.

Door IFN-ELISPOT wordt de cellulaire immuun respons bekeken. Hiertoe wordt een 96-well membraan gecoate plaat geïnduceerd met monoklonaal antilichaam voor muis gamma interferon. Door analyse van de matrijzen worden individuele epitoop-bevattende peptides geïdentificeerd. Dit gebeurd door het maken van peptide poolen met 15-mer peptiden, die 11 aminozuren overlappen van het gehele VN/1203/04 HA proteïne. Deze wordt uitgezet tegenover een niet geconserveerde sequentie van HK/156/97. Aan de hand hiervan is het mogelijk om de mate en de breedte van de immuniteit te testen.

Ieder van de dieren die werden geïmmuniseerde met de volledige HA, HA1 of HA2 subunits vertonen sterke cellulaire reacties voor HA peptiden. Deze tonen een gemiddelde gevoeligheidspiek van 1 HA-specifieke T-cel per 1200 splenocyten. Cumulatieve cellulaire immuunreacties zijn HA specifiek. Volledige immuniteit wordt alleen ontwikkeld wanneer er geïmmuniseerd wordt met volledig HA.

Er treedt cellulaire respons tegen de geconserveerde HA1 regionen van Ad.VN213-227 en Ad.VN241-255 op, terwijl de respons op de aminozuren (145-163), welke verschilden tussen de groepen, beperkt blijft tot de dieren die met dit subtype zijn ingeënt. Door de immunisering met Ad.VNHA2 blijkt immunodominant epitoop in HA2 aanwezig te zijn. Ad.VNHA toont een subdominante respons voor het SFFRNVVWLIKK epitoop op de HA1 peptiden van VN153-167/VN157-171. De aard van de hA1-specifieke immuun respons op AD.HA1 veranderd door immunisering met Ad.VNHA. Deze immunisering zorgt voor een lagere mate van reactie op VN145-159/VN149-163, VN213-227 & VN241-255. Hieruit valt op te maken dat op adenovirus-gebasserde vaccinatie, een sterke cellulaire immuun voor HA geeft. Deze reactie lijkt in het geval van de HA2 vaccinatie dominant te zijn boven de humorale immuun respons.

Cellulaire immuun reactie bij ingeente muizen
Alle muizen werden 8 weken na de 2e immunisering intranasaal geïnoculeert met VN/1203/04 (LD50). Muizen met Ad.5 vector vertoonden na 3 dagen gewichtverlies en stierven na 6 to 9 dagen. Dieren die Ad.VNHA, Ad.VNHA1, of Ad.HKHA1 immunisering ondergaan hadden, toonden slechts gering verlies in gewicht en toonden geen sterfte. De dieren uit de Ad.VNHA2 groep vertoonde wel een groot verlies in lichaamsgewicht, toch herstelde 3 van de 5 zich na de 8e dag.

Hieruit is de conclusie te trekken dat HA2 vaccinatie primaire cellulaire immuun reacties geeft. Op de 3e of 6e dag na de inoculatie, werden er 3 dieren per groep gedood. Dit werd gedaan om hieruit virus te kunnen isoleren. Bij de HA1 en HA2 subunit vaccinaties, werden grote hoeveelheden virus geïsoleerd. Bij de met het volledige HA gevaccineerde muizen, werden er weinig gevonden.

Werkzaamheid van vaccinatie bij kippen
Gezien hun rol in de verspreiding van HPAI in Zuidoost.-Azië, moet de werkzaamheid van het adenovirus-gebaseerde vaccin getest worden op de daar inheemse kippen. Er is een aanzienlijk verschil tussen de gevoeligheid van kippen voor het H5N1 virus ten opzichte van muizen. Kippen sterven gemiddeld na 2 dagen, muizen na 8.

Dit is te verklaren aan de hand van de eerder behandelde verschillen in virus replicatie verschillen tussen beiden dieren.

Vaccinatie bij kippen vond alleen plaats met het volledige HA. Vier groepen kippen, vrij van pathogenen, werden geïmmuniseerd met 5 x 1010 Ad.VNHA of de lege Ad.5 vector. Na 21 dagen vond inoculatie met EID50 van VN/1203/04 21 plaats. Deze dosis komt overeen met het 10,000-voudige van dat bij de muizen. De vaccinatie resulteerde bij alle subcutaan gevaccineerde kippen in een inductie van HI antilichaam voor VN/1203/04. Alle kippen in deze groep overleefden, zonder ziektebeelden te vertonen. Daarin tegen, stierven alle gecontrolleerd-geïmmuniseerde kippen. Bij slechts 1 van de kippen die intranasaal werd geïmmuniseerd met Ad.VNHA, vertoonde HI antilichaam. Bij dezelfde groep werd 50% ziek en de andere 50% stierf.

Vaccinatie

Een adenovirus moet een bepaalde route afleggen in het lichaam voordat het in de darmen gevonden kan worden. Wat deze resultaten meteen verklaart, want de verspreiding richting de darmen verloopt nasaal makkelijker dan subcutaan. Na orale en cloacale metingen van de virus titers bleek dat het subcutaan toegediende vaccin de pathogeniteit aanzienlijk verlaagd. In het maagdarmkanaal werden geen sporen gevonden van het virus, in het ademhalingsstelsel waren de titers 3 keer zo klein als anders.

Bespreking

Wanneer de verspreiding van het H5N1 virus verder door zal zetten, zal er in de toekomst een grote behoefte ontstaan om nieuwe methoden van vaccin productie te ontwikkelen. Het bestuderen van de HA-specifieke immuunreacties in de toekomst leiden tot het ontdekken van een nieuwe manier van vaccin productie. Dit zal niet alleen toepasbaar blijken bij H5N1, maar zal ook leiden tot de ontwikkeling van vaccins tegen andere virussen. Deze productie via adenovirale vectoren zal opgegroeid worden via de klassieke kippenei methode.

Immunisering met geïnactiveerd H5N1 virus is langdurig werkzaam tegen homologe virussen, maar de bescherming is maar gering voor andere H5N1 virussen. Vaccinatie met op adenovirus gebaseerde HA uit H3N2 efficiënt te zijn bij zowel muizen als zwijnen.

Hierop voort gebouwd, blijkt uit deze studie wat de rol is van de T-cel respons op een op adenovirus gebaseerd HA vaccin. Het feit dat een HA2 vaccin een dier gedeeltelijk beschermt en er geen humorale respons optreedt, suggereert dat de cellulaire respons complementair is met het humorale gedeelte. Deze wordt verder onderbouwd doordat met een anti-H1N1 nucleoproteïne vaccinatie een T-cel respons teweeg gebracht wordt. Deze biedt ook bescherming tegen andere subtypen van het virus. Hieruit is de conclusie te trekken dat humorale immuniteit een dier beschermd tegen homologe virussen. Bij herhaalde stimulering van T-cel respons echter, is er wel een vertraging in de reactie, maar zien we ppl een veel bredere bescherming tegen verschillende influenza subtypen.

Adenovirus vectoren geven het voordeel van een relatief veiligere manier van werken. Maar buiten dit voordeel, geeft het ook de mogelijkheid om grote hoeveelheden vaccin te produceren. Kortom, de ontdekte mogelijkheid om met adenovirale vectoren een T-cel respons te starten is uiterst belangrijk en kan hiernaast ook voor andere virussen gebruikt worden. Hierdoor vraagt het om verdere bestudering.

Sommige mensen zullen immuun blijken te zijn tegen de gebruikte vector. Hierdoor wordt efficiëntie bij een mogelijke wereldwijde vaccinatie tegen HPAI mogelijk verlaagd.

In fase I van de klinische test bij mensen bleek een op adenovirus serotype-5 gebaseerd H1N1 vaccin veilig en werkzaam te zijn. De vaccinatie bleek ook effectief te zijn bij individuen met antiadenovirus antilichaam, waaruit mogelijk blijkt dat mensen niet vector-specifiek immuun kunnen zijn. Toch wordt er nog gezocht naar meerde adenovirus subtypen, zodat deze gebruikt kunnen worden voor de ontwikkeling van alternatieve vectoren.

De reden van de statistische verschillen bij overlijden (Thailand 66.7%, Vietnam 80% en Hongkong 33%) blijven onduidelijk.

Het NA proteïne speelt een rol bij het vrijkomen van nieuwe virusdeeltje uit de gastheercel. Er bestaat een mogelijkheid dat de deletie van aminozuur residuen deze mogelijkheid af nemen.

Mutatie in een kortere NA blijkt toch nog de mogelijkheid te kennen om zich efficiënt te verspreiden. Dit is mogelijk te danken aan een glycosylatie site op het uiteinde van het HA molecuul, welke de deze kortere NA compenseert.

Zowel de virus isolaten van 1997 als de virussen met genotype Z kennen deze 2 mutaties, de parentale isolaten hebben deze niet. Hierdoor ontstaat het vermoeden dat de mutatie van NA en HA een direct verband kennen me de pathogeniteit van het virus.

Het is nog niet duidelijk hoe de H5N1 Thailand virussen resistent zijn geworden voor amantadine. Voor zover bekend kennen zij namelijk geen selectie druk van dit antivirale medicijn.

Zowel de monsters die pathogeen zijn voor mensen, als de gene die pathogeen zijn voor kippen kennen de zelfde receptor-bindings plaatsen. Na analyse werd de volledige identiteit van de aminozuur residuen van de 6 isolaten uit Thailand vastgesteld.

Ondanks dat 2 monsters van de 2003 isolaten uit Hongkong binden aan 2-6 silaosaccharide, vinden mens-op-mens besmettingen weinig tot niet plaats. Dit blijkt te komen, doordat de virussen toch een voorkeur lijken te kennen voor de 2-3-sialosaccharides van vogels.

Deze 2 monsters hebben onderling slechts een verschil van 2 aminozuren (Ser-159-ASN & Ser-227-ASN). Hierin is Asn227 verantwoordelijk voor de shift in receptor specificiteit. Slechts 1 mutatie is dus verantwoordelijk voor de binding aan vogels of aan mensen.

Na 1997 zijn bij vogel-achtigen verschillende genotypen gevonden. Door deze grote diversiteit is het erg opvallend dat er nooit eerder een grote uitbraak plaats heeft gevonden. Van alle mutaties die in deze verscheidene genotypen gevonden werden, is het HA proteïne het meest constant en hierdoor zal deze de meest cruciale rol spelen in het opbouwen van een immunologische afweer. Het genotype dat gevonden werd bij de uitbraak van 2003-2004 is meer aangepast op de overbrenging op vogels, hierdoor is dit genotype meer verspreid onder de vogel populatie dan de andere genotypen.

Uit de resultaten omtrent het ontwikkelen van een vaccin, valt de conclusie te trekken dat de ontwikkeling van een “replicatiedefectief adenovirus-gebaseerd” vaccin de beste uitkomst biedt in de strijd tegen een nieuw pandemie. Dit omdat het veel sneller te produceren is, dan de huidige methode van opkweken in kippen eieren.

Gezien de succesvolle immuniteit van kippen, kan verdere immunisering van gevogelte een economisch voordeel opleveren.
© 2007 - 2008 Heidweiller, gepubliceerd in Ziekten (Mens en Gezondheid) op 01-02-2007, laatst gewijzigd op 07-05-2008. Het auteursrecht van dit artikel ligt bij de infoteur. Zonder toestemming van Heidweiller is vermenigvuldiging van dit artikel verboden. Meer...

Verwante artikelen

  • Vogelgriep blijft een bedreiging voor de mens: De angst voor de vogelgriep blijft actueel. Zeker nu de griepmaanden weer voor de deur staan. Op 25 september 2007 werd nog een medewerker van een Nederlands ru…
  • TBC (Tuberculose): TBC is een afkorting voor tuberculose. Tuberculose is een bacterie. TBC is waarschijnlijk een ‘menselijke ziekte’ geworden toen de mensen dieren gingen houden om zichzelf in eten en drinke…
  • Bof (Parotitis epidemica): De bof (parotitis epidemica) behoort tot de zgn. aërogene virusinfecties. Veel virussen hebben een redelijke doch kortdurende overleving in de lucht. Ze bevinden zich in microscopi…
  • Mutaties in onze genen: Ons DNA is voortdurend onderhevig aan allerlei factoren van buitenaf. Af en toe gaat er wat fout, er verandert wat. Een verandering in onze genen wordt een mutatie genoemd. In tegenst…
  • Griep of verkoudheid?: Je voelt je niet zo lekker. Je neus snottert en je hoest wat. Men zegt dan al snel dat ze een ‘griepje’ hebben, maar dat is niet terecht. De meeste keren gaat het om een verkoudheid, d…

Bronnen en/of referenties

  • 1. http://nl.wikipedia.org/wiki/Antigene_shift
  • 2. http://nl.wikipedia.org/wiki/Antigene_drift
  • 3. http://nl.wikipedia.org/wiki/Vogelgriep
  • 4. Journal for General Virology 86 (2005), Molecular characterization of the complete genome of human influenza H5N1 virus isolates from Thailand. (Pilaipan Puthavathana et al.)
  • 5. Hoffman et al. 2001
  • 6. Journal for Virology (Februari 2006), Protection of Mice and Poultry from Lethal H5N1 Avian Influenza Virus through Adenovirus-Based Immunization. (Wentao Gao et al.)
  • 7. Virology (Januari 2006), Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. (A. Gambaryan et al.)
  • 8. Chest (Januari 2006), Avian Influenza Virus Infections in Humans. (Wong et al.)
  • 9. Journal of Experimental Medicine (Maart 2006), The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04. (Salomon et al.)

Reageer op het artikel "Vogelgriep literatuurstudie"


Door Gaia op 21-08-2007

Artikel met bronvermeldingen en goed geschreven