Darmkanker en het APC gen

Kanker ontstaat door een serie van mutaties in verschillende genen die er onderandere voor zorgen dat de cel ongecontroleerd gaat delen. Dit is ook het geval bij darmkanker. Eén van de gen mutaties die een belangrijke rol speelt bij het ontstaan van darmkanker is een mutatie in het APC gen.

1.Probleemstelling

Wat is de functie van het Adenomatous Polyposis Coli gen in gezonde epitheelcellen in de dikke darm, op welke wijze dragen mutaties in dit gen bij aan het ontstaan van dikke darmkanker en op welke manier kan deze vorm van dikke darmkanker met behulp van dendritrische celtherapie voorkomen worden?

2.Beschouwing

2.1 beantwoording deelvraag 1

Deelvraag1: Wat is de functie van het Adenomatuos Polyposis Coli gen in gezonde epitheelcellen in de dikke darm?

In het darm epitheel bevinden zich stamcellen die zich nog moeten differentiëren. Het APC gen heeft een functie bij het reguleren van de cel groei en cel dood binnen het darmepitheel, dit is een zeer belangrijke functie die nodig is om ervoor te zorgen dat geen overtollige groei ontstaat. De onderwerpen die in dit deel behandeld worden hebben te maken met deze belangrijke functie van APC binnen het darmepitheel.

2.1.1 Beknopt de opbouw van APC
Het APC gen bevind zich op chromosoom 5 tussen de posities 21 en 22. Het APC gen bestaat uit 8535 base paren (bp), bevat 21 exonen en codeert een eiwit van 2842 aminozuren van 310 kDa dat zowel in het cytoplasma als in de celkern voorkomt. Het APC eiwit is structureel complex, met vele mogelijke eiwit/eiwit interactie plaatsen.

2.1.2 De functie van APC in het Wnt-signaaltransductie pad
Signaaltransductie is het doorgeven van signalen van cel tot cel, dit gebeurd vooral via paden van eiwitten. Een eiwit kan bijvoorbeeld ingeschakeld worden door een fosfaatgroep op een bepaalde plek aan te hechten, dit is fosforylatie.
Het signaaltransductie pad waar het APC eiwit een rol in speelt wordt het Wnt-signaaltransductie pad genoemd. Het evenwicht tussen celdeling en celdood wordt door signaaltransductie geregeld. Gecontroleerde signaalstansductie is zeer belangrijk voor verschillende dynamische weefsels in het lichaam die gekenmerkt worden door het regelmatig vernieuwen van cellen. Voorbeelden van dynamische weefsels zijn de darm, het beenmerg en de huid. Deze weefsels bevatten volwassen stamcellen, dit zijn ongespecialiseerde cellen die voortdurend delen, zich specialiseren en vervolgens beschadigde en verouderde cellen vervangen. Het darmkanaal is bedekt met een laag cellen, de epitheelcellen, die plooien vormt, de villi en crypten, zie figuur 2. Aan de onderkant van de crypt bevinden zich darmstamcellen. De stamcellen delen zich continu om zo nieuwe cellen te genereren, deze cellen migreren omhoog richting de villi en specialiseren zich om diverse functies te kunnen uitvoeren, zoals de adsorptie van water en voedingstoffen. Op het topje van de villus gaan deze cellen geprogrammeerd dood en worden deze in het darmkanaal losgelaten. In afwezigheid van het Wnt-signaal buiten de cel wordt signaaltransductie binnen de cel door APC geremd zodat de darmstamcel migreert, zich specialiseert en op het juiste moment uiteindelijk doodgaat. In aanwezigheid van het extracellulaire Wnt-signaal wordt APC zelf geremd zodat de signaaltransductie door kan gaan en de cel zich blijft delen. Door de werking van APC wordt de verhouding tussen nieuw gevormde cellen, ook wel celproliferatie genoemd, en cellen die dood gaan op pijl gehouden.

In het Wnt signaaltransductie pad werkt APC samen met andere eiwitten zoals axine, β-catenine en glycogeen3β kinase (GSK3β).APC wordt bij afwezigheid van een Wnt signaal actief wordt en bind samen met GSK3β en axine aan β-catenine. Dit zorgt er voor dat β-catenine gefosforyleert wordt. Het gefosforyleerde β-catenine wordt afgebroken in deeltjes. Β-cantenine kan hierdoor niet de celkern in. In de celkern zijn leden van de GSK3β T-cel factor (TCF) lymfoide enhancer factor (LEF) familie te vinden, deze genen kunnen als ze binden met β-catenine zorgen voor de transcriptie van de oncogenen c-myc en cyline. Een oncogen is een gen dat bij expressie of verhoogde activiteit het ontstaan van kanker bevordert. Als β-catenine niet in de celkern komt worden TCF en LEF niet geactiveerd en er vind geen transcriptie plaats van de oncogenen c-myc en cyline. De cel verplaatst zich richting de vili en specialiseert zich.

Biij aanwezigheid van een Wnt signaal wordt APC gedeactiveerd wordt, hierdoor bind APC niet met β-catenine. β-catenine wordt niet gefosforyleerd en niet afgebroken, hierdoor kan β-catenine de kern in komen. In de kern bind β-catenine met TCF en LEF waardoor transcriptie van de oncogenen c-myc en cyline plaatsvindt. De cel blijft zich hierdoor delen en verplaatst en specialiseert zich niet.

2.1.3 De functie van APC bij cellulaire adhesie
APC heeft interactie met β-catenine en β-catenine heeft interactie met leden van de cadherine familie. Leden van de cadherine familie zijn eiwitten die op het celoppervlak zitten, ze spelen een belangrijke rol bij cel-cel adhesie. APC bind met β-catenine, β-catenine bind met epitheel cadherine (E-cadherine) en vormt uiteindelijk een complex met het actine cytoskelet. Het cytoskelet is een driedimensionaal netwerk binnen een cel dat zorgt voor de stevigheid, vorm en bewegelijkheid van de cel. Het cytoskelet kan uit drie verschillende filamenten bestaan actine filamenten, microtubuli en intermediaire filamenten. Er wordt in hoofdstuk 2.1.4 meer uitgelegd over het cytoskelet. Het gevormde complex van APC, β-catenine, E-cadherine en het actine cytoskelet zorgt voor behoud van stabiele cel-cel adhesie.

2.1.4 De functie van APC bij het stabiliseren van het cytoskelet
Het cytoskelet is een netwerk dat bestaat uiteiwit filamenten. Het cytoskelet zorgt ervoor dat cellen verschillende vormen kunnen aannemen, de componenten in de cel kunnen rangschikken, interactie kunnen hebben met de omgeving en de grote hoeveelheid cytoplasma kunnen ondersteunen. Het cytoskelet is een dynamische structuur die continue gereorganiseerd wordt als de van vorm verandert, deelt en reageert op de omgeving. Het cytoskelet kan opgebouwd zijn uit drie verschillende filamenten, actine filamenten, microtubuli of intermediaire filamenten. Deze drie verschillende filamenten hebben verschillende eigenschappen.
APC heeft een rol bij het actine cytoskelet, door een brug van β-catenine en α-catenine kan APC binden aan actine. Het is niet precies duidelijk hoe dit complex bijdraagt aan de stabiliteit van het cytoskelet, maar onderzoeken hebben uitgewezen dat APC mutaties bij ratten onder andere instabiliteit van het cytoskelet veroorzaken.

2.1.5 De functie van APC bij de celcyclus
Er zijn twee vormen van celdeling, mitose en meiose. Meiose komt alleen voor bij de vorming van geslachtscellen, de chromosomen gaan uitelkaar maar verdubbelen niet. Mitose is de vorm van celdeling die bij de rest van de lichaamscellen voorkomt, de chromosomen worden verdubbelt en elke ontstane cel heeft een complete set chromosomen.

APC zorgt er mede voor dat de cellen die ontstaan bij mitose een complete set chromosomen hebben. De chromosomen worden na verdubbeling ieder naar een kant van de cel getrokken door draden, deze draden zijn microtubuli en zijn opgebouwd uit het eiwit tubuline. APC zorgt voor de juiste connectie tussen de microtubuli en de chromosomen. Aan het uiterste uiteinde van de microtubuli zit het end-bindende eiwit EB1. APC bind aan de EB1 aan het uiteinde van de microtubuli en rekt ze uit naar de chromosomen. Dit proces zorgt ervoor dat de twee cellen die ontstaan beide euploide zijn. Euploide cellen hebben een complete set chromosomen. Als dit proces niet goed werkt kunnen aneupoide cellen ontstaan, dit zijn cellen die abnormale aantallen chromosomen hebben.

2.1.6 De mogelijke functie van APC bij apoptose
Apoptose is het proces van geprogrammeerde celdood, bij dynamische weefsels zoals het darmepitheel is het belangrijk dat de verhouding tussen nieuwe cellen en cellen die dood gaan in balans is. Het is waarschijnlijk dat APC ook een indirecte rol speelt bij apoptose regulatie, omdat door de introductie van wid-type APC in kanker cellijnen met mutant APC de celdood door apoptose bevorderde. Er is bewijs dat de regio van APC die waarschijnlijk betrokken is bij de regulatie van apoptose samenvalt met de regio die β-catenine bind. .

2.2 Beantwoording deelvraag 2

Deelvraag 2: Hoe kunnen mutaties ontstaan in het Adenomatous Polyposis Coli gen?

2.2.1 Gen mutatie in het algemeen
Een DNA molecuul bestaat uit twee lange polipeptide ketens die een dubbele helix vormen. Elk van deze ketens is opgebouwd uit vier typen nucleotiden en de twee ketens worden bij elkaar gehouden door hydrogene bindingen. Nucleotiden in DNA zijn opgebouwd uit het suiker deoxyribose, een fosfaatgroep en een base die adenine (A), cytosine (C), guanine (G) of thymine (T) bevat. De twee DNA ketens worden bij elkaar gehouden door hydrogene bindingen tussen de basen van de verschillende ketens. De basen binden niet incidenteel, A bind altijd aan T en G bind altijd met C.

Om een functioneel chromosoom te vormen moet een DNA molecuul zich kunne replicere. Dit gebeurd tijdens de celcyclus. Het proces van DNA replicatie wordt begonnen door initiërende eiwitten die aan het DNA binden, de hydrogene bindingen verbreken en de twee ketens uit elkaar trekken. De punten waar het DNA als eerste uit elkaar gehaald wordt worden gevormd door een bepaalde nucleotide sequentie die de replicatie oorsprongen genoemd worden. In menselijk DNA zijn er veel van deze replicatie oorsprongen zodat replicatie snel kan verlopen. Wanneer een initiërend eiwit aan het DNA bind bij een replicatie oorsprong en daar de dubbele helix opent wordt een groep van eiwitten aangetrokken die de replicatie uitvoeren. Deze groep opereert als een eiwit machine waarvan elk lid een specifieke functie heeft.
Een andere DNA sequentie vormt de telomeren die aan elk van de twee uiteinden van een chromosoom zitten. Telomeren bevatten repeterende nucleotide sequenties die ervoor zorgen dat de uiteinden van de chromosomen gerepliceerd kunnen worden. Ook zorgen de telomeren dat de uiteinden van de chromosomen niet voor een gebroken DNA molecuul worden aangezien.

Bij het repliceren van DNA kunnen fouten gemaakt worden, bijvoorbeeld een G die met een T wordt gecombineerd of een C die met een A gecombineerd wordt, een fout bij het repliceren van DNA wordt een mismach genoemd. Er is een systeem welke deze fouten weer kan herstellen, dit systeem is het ‘mismach repair’ systeem. Als er door de replicatie machinerie een fout word gemaakt wordt, word dat door een complex van mismach repair eiwitten herkent. Het complex verwijdert een van de twee DNA strengen die betrokken zijn bij de mismach en synthetiseert de verwijderde streng opnieuw.
Het replicatie systeem maakt ongeveer één fout per 107 gekopieerde nucleotiden, als een mismach niet door het mismach repair systeem word herstelt resulteert de mismach in een mutatie. Een mutatie is een permanente verandering in DNA. Het mismach repair systeem herstelt ongeveer 99% van de gemaakte kopieer fouten. Hierdoor wordt de kans op een mutatie verkleind van 1 per 107 gekopieerde nucleotiden tot 1 per 109 gekopieerde nucleotiden.

De gevolgen van mutaties kunnen verschillend zijn, maar het komt neer op "loss-of-function" (het gen dat gemuteerd wordt werkt niet meer) of "change-of-function" (het gen werkt op een andere manier, het wordt bijvoorbeeld altijd actief).
Er zijn twee typen mutaties, mutaties die in de geslachtscellen zitten en doorgegeven worden aan het nageslacht en somatische mutaties. Somatische mutaties zijn mutaties die bij een individu ontstaan en niet doorgegeven worden aan het nageslacht.

2.2.2 Uitgebreid de opbouw van het APC gen
Zoals eerder vermeld bevind het APC gen zich op chromosoom 5q21. Het product van het APC gen is een 310 kDa eiwit gelokaliseerd in zowel het cytoplasma als de celkern. In de volgende afbeelding is de opbouw van het APC eiwit weergegeven.

Het APC eiwitbestaat uit verschillende domeinen die ieder een eigen functie hebben.Aan de kant van de N-terminus zitten oligomerisatie en een Armadillo-repeat bindingsdomeinen. Aan de kant van de C-terminus zitten een EB1 en een tumorsuppressor eiwit DLG binding domein. Het APC eiwit bevat ook drie 15-aminozuren en zeven 20-aminozuren repeat regio’s, deze zijn betrokken bij negatieve regulatie van het β-catenine eiwit in cellen. De eerste 20-aminozuren repeat in het APC gen is gelokaliseerd aan het 5’ end van de mutatie cluster regio (MCR), over de MCR wordt in hoofdstuk 2.2.3 meer verteld. Er zijn minimaal vijf APC nucleaire export signalen (NES). De domeinen van APC zorgen ervoor dat het APC eiwit interactie kan hebben met andere eiwitten. De domeinen worden ieder besproken.

Het oligomerisatie domein.
De aanwezigheid van een oligomerisatie domein aan de N-terminus betekend dat wild-type APC dimeren kan vormen met zowel wild-type als mutant APC eiwitten[2]. Als het aantal beschikbare wild-type APC gereduceerd is, niet alleen door de aanwezigheid van een mutant eiwit, maar ook door de dimerizatie van de overgebleven wilt-type APC met mutant eiwit, is het mogelijk dat APC mutanten een dominant negatief effect hebben in het reduceren van de tumorsupressor functie van APC.

De armadillo regio
De armadillo regio bestaat uit zeven repeats[2]. Dit domein is blijft invariabel bij mutant APC eiwitten. De armadillo regio van APC bind eiwit fosfatase 2A (PP2A), een enzym dat ook axine bind. De armadillo regio bind ook aan guanine nucleotide exchange factor (ASEF), deze speelt een rol bij de stabilisatie en bewegelijkheid van het actine cytoskelet. Het is waarschijnlijk dat het armadillo domein essentieel is voor cellulair overleven, maar het is onwaarschijnlijk dat het een integrale rol speelt bij de tumor supressie functie van APC.

15-aminozuur repeats
Drie 15-aminozuur repeats komen voor russen aminozuur 1020 en 1169, deze leveren bindingsplaatsen voor β-catenine. Het binden van β-catenine aan deze 15-aminozuur delen op APC markeert β-catenine niet voor dowenregulatie, in tegenstelling tot het binden aan de 20-aminozuur delen. Net als de armadilloregio zitten de 15-aminozuur repeats nog in mutant APC eiwitten.

20-aminozuur repeats
De centrale regio van het APC eiwit bevat een serie van zeven 20-aminozuur repeat motieven. Fragmenten van APC die deze repeats bevatten binden β-catenine, maar alleen een enkele 20-aminozuur repeat is essentieel voor zo’n binding. Negatieve regulatie van β-catenine is afhankelijk van de aanwezigheid van minimaal drie van de zeven 20-aminozuur repeats in APC.

Axine bindingsplaatsen
Axine bind aan APC op bindingsplaatsen aanwezig binnen de regio van de β-catenine bindende 20-aminozuur repeats. De axine bindingsplaatsen op APC liggen tussen de derde en vierde, tussen de vierde en vijfde en na de zevende 20-aminozuur repeats. Axine gedraagt zich als een negatieve regulator binnen het Wnt-signaleringspad door het reduceren van het aantal van β-catenine beschikbaar voor transcriptie activatie.

Basis domein in APC
Het basis domein licht in de C-terminus van APC tussen aminozuren 2200 en 2400. De naam van het domein is afgeleid van de grote proportie van (basis) arginine en lysine residuen in deze regio, maar het bevat ook een abnormaal hoog percentage van eiwit residuen. Het basis domein waarschijnlijk de plek waar het APC eiwit de microtubuli bind, een theorie die bevestigd is door in vitro observaties dat de C-terminus van APC microtubuli bind en polymerisatie van het eiwit tubuline stimuleert. Dit domein kan waarscheinlijk niet specifiek en gecontroleerd binden aan de microtubuli.

EB1 binding domein in APC
De C-terminus van APC bevat ook een bindingsplek voor het end-bindende eiwit EB1. EB1 is gebonden aan de punten van microtubuli in alle fases van de celcyclus. APC bind aan de EB1 aan het end van microtubuli.

HDLG bindingsplaat in APC
HDLG staat voor humane disc large en is de humane homoloog van het discs large tumor supressor eiwit dat bij fruitvliegjes gevonden wordt. De C-terminus van APC bind aan HDLG.

2.2.3 Beschrijving van de mutatie cluster regio
Uit onderzoek is gebleken dat meer dan 90% van de somatische mutaties in het APC gen binnen een gebied voorkomt dat maar 10% van de totale APC coderingssequentie omvat. Dit gebied wordt de mutatie cluster regio (MCR) genoemd. De MCR ligt tussen de codons 1250 en 1550. Binnen de MCR zijn twee ‘hotspots’ gevonden voor somatische mutaties bij de codons 1309 en 1450.

2.3 Beantwoording deelvraag 3

Deelvraag 3: Op welke manier dragen mutaties in het Adenomatous Polyposis Coli gen bij aan het ontstaan van dikke darmkanker?

2.3.1 Het ontstaan van kanker algemeen
Om orde te bewaren als ons lichaam groeit of oude cellen vernieuwd moeten cellen gaan delen als er nieuwe cellen nodig zijn en stoppen met delen als er geen nieuwe cellen nodig zijn, moeten cellen blijven leven als dit nodig is en sterven als dit nodig is, moeten cellen de juiste gespecialiseerde functie behouden, op de juiste plaats zitten en niet op verkeerde plaatsen gaan zitten. Als een enkele cel zich niet gedraagt volgens deze regels heeft dit geen significante schade voor een groot organisme, maar als een enkele cel een genetische mutatie heeft die ervoor zorgt dat de cel kan overleven en zich kan delen wanneer dit niet gewenst is en zo dochtercellen produceert met dezelfde eigenschappen kunnen er uiteindelijk vele cellen ontstaan die zich niet volgends deze regels gedragen. Dit is wat er gebeurd bij het ontstaan van kanker. Kanker cellen worden gedefinieerd door twee overdraagbare eigenschappen, ten eerste delen de cellen en hun nageslacht buitensporig door afwezigheid van de normale beperking en ten tweede koloniseren de cellen plaatsen die normaal voor andere cellen bedoelt zijn. De combinatie van deze twee eigenschappen zorgt ervoor dat kanker dodelijke gevolgen kan hebben. Cellen die alleen de eerste eigenschap, maar niet de tweede eigenschap hebben delen buitensporig maar blijven in een groep bij elkaar in een enkele massa en vormen een tumor die goedaardig is, dit type tumor kan vaak geheel verwijdert worden met een operatie. Bij kanker hebben de cellen beide eigenschappen en wordt omliggend weefsel binnen gedrongen, in dit geval is de tumor kwaadaardig. Kwaadaardige tumorcellen met deze koloniserende eigenschap kunnen van de primaire tumor losbreken, in de bloedsomloop of de lymfatische vaten terechtkomen en secundaire tumoren vormen in andere delen van het lichaam, ook wel uitzaaiingen of metastasen genoemd.

Kanker is fundamenteel een genetische ziekte, het ontstaat als een consequentie van mutaties in het DNA. Het verschilt van andere genetische ziektes omdat de mutaties die voorafgaan aan kanker vaak somatische mutaties zijn, dit houd in dat deze voorkomen in individuele cellen van het volwassen lichaam. Erfelijke mutaties zitten in de geslachtscellen waaruit een meercellig organisme groeit, kanker die hierdoor ontstaat wordt erfelijke kanker genoemd.
De omgeving kan effect hebben op somatische mutaties, stoffen die mutaties kunnen veroorzaken worden mutageen genoemd, bekende voorbeelden hiervan zijn ioniserende straling, chemische carcinogenen, tabaksrook en radioactiviteit. Mutaties kunnen ook spontaan ontstaan. Invloeden van buitenaf zoals tabaksrook zorgen maar voor een klein deel van mutaties verantwoordelijk voor kanker.
Een kanker cel ontstaat niet na een enkele mutatie is de cel, er zijn meerdere mutaties nodig in de cel. Deze mutaties vinden niet in één keer plaats, maar vaak verspreid over een periode van jaren. Dit is de reden dat kanker vaker voorkomt bij oudere mensen. Ook bevatten menselijke kanker cellen niet alleen mutaties maar ze zijn ook genetisch instabiel. De genetische instabiliteit is een resultaat van mutaties die in de weg staan van accurate replicatie van het genoom en hierdoor het aantal mutaties verhogen, mutaties die de efficiëntie van DNA herstel verminderen of mutaties die het aantal chromosomale breuken en herschikkingen verhogen met als gevolg een onstabiel karyotype.
Er zijn verschillende gevolgen van mutaties. Mutaties die het gen product hyperactief maken kunnen erg gevaarlijk zijn. Deze mutaties hebben een dominant effect, mutatie van één gen kopie kan al problemen veroorzaken. Een gen met dit type mutatie wordt een oncogen genoemd, de corresponderende normale vorm van het gen wordt dan een proto-oncogen genoemd. Bij andere genen ligt het gevaar in mutaties die de gen functie vernietigen. Deze mutaties zijn meestal recessief, beide gen kopieën moeten weg of geïnactiveerd zijn voor een effect te merken is. Een gen met dit type mutatie wordt een tumor suppressor gen genoemd.

2.3.2 De manier waarop de verstoring van de functies van het APC gen door mutaties dikke darmkanker veroorzaken.
Mutaties in het APC gen worden gezien als een van de eerste gebeurtenissen bij de initiatie en progressie van darmkanker. Bij 60 tot 80% van alle sporadische darmkanker patiënten zijn mutaties in het APC gen te vinden. Mutaties in het APC gen hebben verschillende effecten. APC mutaties binnen de MCR resulteren in een APC eiwit dat alle axine bindingsplaatsen mist en op een of twee na alle 20-aminozuur β-catenine bindingsplaatsen. Het verlies van deze bindingsplaatsen verstoort het Wnt signaaltransductie pad.

Onder invloed van Wnt signaaltransductie bind APC normaal met onder andere axine, β-catenine en GSK3β . Hierdoor wordt β-catenine afgebroken zodat deze geen mogelijkheid heeft om de celkern binnen te dringen en te binden met TCF en LEF te binden. TCF en LEF krijgen hierdoor geen kans voor transcriptie van de oncogenen c-myc en cycline. Bij mutaties in het APC gen die ertoe leiden dat het APC eiwit niet meer kan binden met axine, β-catenine en GSK3β, wordt β-catenine niet meer afgebroken en gaat het de celkern binnen. In de celkern bind β-catenine met TCF en LEF waardoor er wel transcriptie van de oncogenen c-myc en cycline plaatsvindt. Door de transcriptie van deze genen blijft de cel zich hierdoor delen en verplaatst en specialiseert zich niet, er ontstaat ongecontroleerde celgroei.

De binding van APC met β-catenine is ook nodig voor juiste cellulaire adhesie. Wildtype APC kan complexen vormen met β-catenine, E-cadhering en het actine cytoskelet. Dit complex zorgt voor behoud van stabiele cel-cel adhesie. Omdat mutant APC vaak bindingsplaatsen voor β-catenine mist kan dit complex niet gevormd worden en is er een instabiele cel-cel adhesie.
Bij het stabiliseren van het cytoskelet is ook en binding nodig tussen APC en β-catenine. Wild-type APC kan via een brug van β-catenine en α-catenine binden aan axine. Mutant APC dat niet met β-catenine kan binden zorgt ervoor dat deze brug niet meer gevormd kan worden en APC dus niet meer met actine kan binden. Het is nog niet precies duidelijk hoe deze verbinding bijdraagt aan een stabiel cytoskelet.

Apoptose is een zeer belangrijk proces en een verstoorde apoptose draagd bij aan het ontstaan van kanker. APC heeft waarschijnlijk een indirecte rol bij apoptose regulering. De regio van APC die waarschijnlijk betrokken is bij de regulatie van apoptose valt samen met de regio die β-catenine bind. Bij mutant APC is deze regio dus ook aangetast en dit heeft effect op de regulatie van apoptose.

APC speelt ook een belangrijke rol bij de celcyclus, het APC eiwit zorgt er voor dat cellen ontstaan uit mitose het juiste aantal chromosomen hebben. APC zorgt voor de juiste connectie tussen de microtubuli en de chromosomen. Aan het uiterste uiteinde van de microtubuli zit het end-bindende eiwit EB1. APC bind aan de EB1 aan het uiteinde van de microtubuli en rekt ze uit naar de chromosomen. Dit proces zorgt ervoor dat de twee cellen die ontstaan beide euploide zijn. Euploide cellen hebben een complete set chromosomen. Als dit proces niet goed werkt kunnen aneupoide cellen ontstaan, dit zijn cellen die abnormale aantallen chromosomen hebben en dit leid tot chromosomale instabiliteit (CIN). CIN komt voor bij ongeveer 85% van de darmkanker gevallen en komt voor in zeer vroege stadia van darmkanker ontwikkeling.

2.4 Beantwoording deelvraag 4

Deelvraag 4: Op welke manier kan deze vorm van dikke darmkanker, ontstaan door mutaties in het Adenomatous Polyposis Coli gen, met behulp van dendritrische celtherapie voorkomen worden?

2.4.1 Beschrijving van de functie dendritische cellen
Dendritische cellen (DC’s) zijn immuun cellen die deel uitmaken van het immuunsysteem van zoogdieren. Ze zijn in lage frequenties aanwezig in weefsels die in contact staan met de omgeving, in de huid en de binnen bekleding van de neus, longen, maag, en darmen. In bloed worden ze vooral in onrijpe staat gevonden. Wanneer ze geactiveerd worden migreren ze maar de lymfoide weefsels waar de interactie hebben met T cellen en B cellen om de immuun respons vorm te initiëren en vorm te geven. In bepaalde fases hebben ze lange stekelige uitsteeksels die dendrieten genoemd worden, hiervan is hun naam afgeleid. Neuronen hebben ook dendrieten maar deze zijn niet gerelateerd aan dendritische cellen. In beide types van cel hebben dendrieten de zelfde functie, het voor een enkele cel mogelijk om contact te maken met een groot aantal andere cellen.

Dendritische cellen beginnen als onrijpe dendritische cellen1. Deze cellen hebben een laag T-cel activatie potentieel. DC’s meten constant de omgeving voor pathogenen zoals virussen en bacteriën. Dit doen ze door pattern recognition receptors (PRR’s) zoals toll-like receptors (TLR’s). TLR’s herkennen specifieke chemische structuren gevonden op pathogenen. Wanneer ze in contact komen met zulke pathogenen worden ze geactiveerd en worden rijpe DC’s. Onrijpe DC’s fagocyteren pathogenen en breken z’n eiwitten af tot kleine stukjes en bij rijping presenteren ze deze fragmenten op hun celoppervlak. Tegelijkertijd up-reguleren ze celoppervlak receptoren die dienen als co-receptoren bij T-cel activatie zoals CD80 en CD86, zo verhogen ze hun mogelijkheid tot het activeren van T-cellen. Ze up-reguleren ook CCR7, een chomotaxische receptor die de migratie van de DC door de bloedstroom naar de milt of via het lymfatisch stelsel naar een lymfeknoop initiëren. Hier activeren ze helper T cellen, killer T cellen en B cellen door hen antigenen te presenteren die afgeleid zijn van een pathogeen. Elke helper T cel is specifiek voor een bepaald antigeen. Alleen antigeen precenterende cellen (macrofagen, B lymfocyten en DC’s) kunnen helper T cellen activeren die hun antigeen nog nooit tegen gekomen zijn. DC’s zijn de meest potente antigeen presenterende cellen.

2.4.2 Beschrijving van het onderzoek van Toshio Iinuma, Sadamu Homma et al. naar dendritische celtherapie.
In deze studie zijn muizen gebruikt waarbij het APC gen gemuteerd is bij codon 1309 en 850 als modellen voor spontane darm tumoren. Bij deze muizen ontwikkelden zich meerdere tumoren in de maag, de twaalfvingerige darm, het middelste deel van de dunne darm(nuchtere darm), het derde deel van de dunne darm (kronkeldarm), de blinde darm en de dikke darm. Tumoren ontwikkelde bij een levensduur van 3 weken en bij 10 weken. De muizen zijn geïmmuniseerd met dendritische cellen (DC’s) geladen met tumorcellen die afgeleid zijn uit een spontane tumor van een muis met een APC mutatie bij codon 1309. De resultaten demonstreren dat de vaccinatie met DC’s geladen met de tumorcellen de ontwikkeling van tumoren verhindert en dat de toediening van inter leukine 12 (IL-12) in combinatie met de vaccinatie bestaande tumoren terugdringt.

Er zijn muizen gebruikt met APC mutaties bij codon 1309 en 850. Er is gezorgt dat de muizen nakomelingen kregen. Va de nakomelingen is het APC genotype bepaald met een hotstart PCR. Muizen waarvan dit onderzoek uitwees dat ze zowel een weil-type als een mutant allel hadden zijn uitgesloten van het onderzoek.

De tumor cellen waarmee de DC’s geladen zijn, zijn verkregen uit een darm tumor van een muis met een APC mutatie bij codon 1309 en worden tumor T cellen genoemd. De tumor T cellen zij aneuploide en hun verdubbel tijd is 24 uur. De DC’s die geladen zijn met tumor T cellen worden DC/T’s genoemd. Voor het maken van de DC/T’s zijn DC’s gebruikt die verkregen zijn uit beenmerg. De DC’s en tumor T cellen zij behandeld met polyethyleen glycol (PEG) om de te verenigen. De DC’s en tumor T cellen zijn bijelkaar gebracht met een ratio van 2:1 en 1 minuut behandelt met 50% PEG bij 37 C. Het PEG is van het mengsel verwijdert. Hierna zijn de cellen overnacht bij 37 C geincubeerd in een medium. Losse cellen zijn verzamelt door afpipeteren na centrifugatie, dit zijn de DC/T’s.

Er zijn verschillende groepen gemaakt. De eerste groep is niet behandeld, de tweede groep is behandeld met DC/T’s, de derde groep is behandeld met DC/T’s en IL-12, de vierde groep is behandeld met DC’s en tumor T cellen apart, de vijfde groep is behandeld met een mix van DC’s en tumor T cellen en de zesde groep is allen met IL-12 behandeld.
De DC/T’s zijn geïnjecteerd in een doses van 1 x 106 cellen per muis in de staart ader bij 6 weken en 8 weken. IL-12 is toegediend in een doses van 0,5 μg per muis in het buikvlies 5 en 10 dagen na de eerste injectie met DC/T’s en 1 week na de laatste injectie met DC/T’s. Alle muizen zijn bij 10 weken oud gedood. De verteringsstelsels vanaf de slokdarm tot aan het rectum zijn verwijdert, gefixeerd door toevoeging van formaldehyde, opengesneden en gekleurd met methyleen blauw. Tumoren in het hele verteringsstelsel zijn geteld.

Er zijn minder tumoren ontwikkeld in de darmen van muizen die behandelt zijn met de DC/T’s dan bij onbehandelde muizen. Ook belet behandeling met DC/T’s en IL-12 de tumor ontwikkeling. De DC/T vaccinatie begon bij 6 weken, toen hadden de muizen gemiddeld 38 tumoren (SD 12). Na 10 weken was het aantal tumoren bij onbehandelde muizen gemiddeld 93 (SD 93). Het aantal tumoren bij de muizen die behandeld zijn met DC/T’s was niet verhoogd. Behandeling met DC/T’s en IL-12 had significant meer effect op tumor suppressie dan behandeling met alleen DC/T’s. Het aantal tumoren bij de muizen die met DC/T’s en IL-12 behandeld zijn was bij 10 weken afgenomen ten opzichte van het aantal tumoren bij 6 weken. Bij muizen die behandeld zijn met DC’s en tumor T cellen apart verschilde het aantal tumoren bij 10 weken niet significant van het aantal tumoren bij onbehandelde muizen. Ook bij de muizen die behandelt waren met een mix van DC’s en tumor T cellen was er geen significant verschil in het aantal tumoren met de onbehandelde muizen. Behandeling met IL-12 alleen had ook geen significant effect op het aantal tumoren. De muizen die behandeld zijn met DC/T’s en IL-12 overleefden langer(156,8 dagen (SD 19,1 dagen)) dan de onbehandelde muizen (109,2 dagen (SD 15,1 dagen)).

3.Discussie en conclusie

3.1 Discussie

Bij een literatuur onderzoek bepaald de betrouwbaarheid van de gebruikte literatuur de betrouwbaarheid van het eindproduct, de scriptie. De literatuur die gebruikt is voor dit onderzoek is verkregen via PUBMED en uit lesboeken, dit zijn zeer berouwbare bronnen en er is vanuit gegaan dat de hieruit verkregen literatuur ook betrouwbaar is.
Er wordt nog steeds veel onderzoek gedaan naar de relatie tussen mutaties in het APC gen en het ontstaan van dikke darmkanker en naar de functie van APC in de gezonde dikke darm. Over een aantal van de onderdelen hiervan is nog niet alles volledig bekend. Hierdoor was het bij sommige onderdelen niet mogelijk om deze volledig te beschrijven.

3.2 Conclusie

Het APC-gen heeft vele functies in het gezonde darmepitheel waaronder: een rol in het Wnt-signaaltransductie pad, behoud van cellulaire adhesie, stabiliseren van het cytoskelet, reguleren van de cel cyclus en mogelijk ook apoptose.
Tijdens het delen van cellen kunnen fouten gemaakt worden bij het kopiëren van het erfelijke materiaal. Hierdoor treden veranderingen op in het DNA deze veranderingen worden mutaties genoemd. In het APC gen is een bepaald deel waar vaak mutaties voorkomen, de MCR. De MCR bedraagt 10% van het totale APC gen. Van alle gerapporteerde mutaties bij zowel erfelijke- als sporadische dikke darmkanker is 90% in de MCR.

Mutaties in het APC gen dragen bij aan het ontstaan van kanker omdat de functies van het APC gen verstoord worden. De functies van wild-type APC zijn zeer belangrijk voor het behouden van gecontroleerde celdeling en celdood.
Bij dentrische celtherapie worden detrische cellen geïmmuniseerd met tumor cellen en bij de patiënt ingebracht. Deze dentrische cellen herkennen de tumor wel en communiceren op de juiste manier met het afweersysteem. Op deze manier wordt de tumor door het eigen lichaam afgebroken. Deze methode is nog zeer experimenteel en er wordt nog onderzoek gedaan op dit gebied.